間接ELISA是一種常用的酶聯免疫吸附試驗，用于檢測特定抗體，例如在感染性疾病診斷中檢測針對特定病原體的抗體。它通過使用二抗來放大信號，從而提高檢測的靈敏度。下面，我們將詳細介紹間接ELISA的原理和步驟。

間接ELISA原理

將純化的抗原包被在微孔板上。然后，加入待測樣本（例如血清），如果樣本中存在針對該抗原的特異性抗體（一抗），則一抗會與抗原結合。洗去未結合的一抗，以去除背景信號。接下來，加入針對一抗物種的酶標二抗，二抗會與結合在抗原上的一抗特異性結合。再次洗滌以去除未結合的二抗。最后，加入酶的底物，底物被酶催化產生可檢測的信號，例如顏色變化。通過測量信號的強度，可以定量或定性檢測樣本中目標抗體的含量。

間接ELISA步驟

步驟一：將已知抗原溶液加入到酶標板孔中，在 37°C 孵育 1-2 小時，或室溫孵育 2-4 小時，使抗原吸附到酶標板底部。最佳的孵育時間和溫度取決于所使用的抗原，可以參考自己試劑盒說明書進行孵育。

步驟二：包被后，用洗滌液（例如 PBS-Tween 20）洗滌酶標板 3-5 次，以去除未結合的抗原，用封閉緩沖液（如BSA或脫脂奶粉溶液）填充所有孔，封閉未結合的點，以防止非特異性結合。封閉步驟有助于減少背景信號，通常在室溫下孵育30分鐘至2小時或4℃過夜（孵育時間可以參考說明書），封閉后，再次用洗滌液洗滌酶標板 3-5 次，以去除多余的封閉液。

步驟三：封閉結束后，將待測樣本（如血清、細胞培養上清等）用合適的稀釋液（例如 PBS-Tween 20）進行稀釋。將稀釋后的樣本加入到相應的孔中，同時設置陽性對照和陰性對照。在 37°C 孵育 1-2 小時，或室溫孵育 2-4 小時，使抗體與包被的抗原充分結合。孵育結束后，用洗滌液（例如 PBS-Tween 20）洗滌酶標板 3-5 次，以去除未結合的抗體。

步驟四：完成樣本孵育后，用洗滌液（例如 PBS-Tween 20）洗滌酶標板 3-5 次，以去除未結合的抗體和其他樣本成分。洗滌時，將洗滌液注滿每個孔，靜置 1-2 分鐘后徹底倒掉，并輕拍酶標板邊緣以去除殘留液體。重復此步驟 3-5 次，或根據實際情況調整洗滌次數。也可以使用洗板機進行洗滌。

步驟五、加入針對樣本中抗體（例如人IgG）的酶標記的二抗，該二抗需特異性識別一抗的物種來源（例如兔）。例如，如果一抗是兔來源的抗體，則需要使用針對兔IgG的酶標二抗。二抗會與結合在抗原上的一抗結合。在 37°C 孵育 1-2 小時，或室溫孵育 2-4 小時。孵育結束后，用洗滌液（例如 PBS-Tween 20）洗滌酶標板 3-5 次，以去除未結合的酶標二抗。

步驟六：加入合適的底物溶液（如TMB或OPD），酶標二抗中的酶會催化底物產生顏色變化。顏色的深淺與樣本中抗體的量成正比。在顏色達到合適的深度后，加入終止液（例如硫酸或鹽酸）來停止顯色反應。使用酶標儀在特定波長下（例如，TMB為450 nm）讀取吸光度值。最后，根據吸光度值，結合標準曲線或其他方法，可以定量或定性分析樣本中抗體的含量。

  以上就是間接ELISA的基本原理和步驟。理解這些原理和步驟對于成功進行間接ELISA實驗至關重要。間接ELISA是一種用途廣泛的技術，可用于檢測各種抗體，并在傳染病診斷、免疫研究等領域具有廣泛的應用價值。