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冷凍細胞:3個基本注意事項

發布時間:2024-12-02     發布作者:上海通蔚生物

  了解如何冷凍細胞是從事生物醫學研究人員必不可少的知識。研究人員通常會冷凍原代細胞和細胞系,以便靈活安排實驗時間并保持細胞質量。冷凍細胞庫可確保檢測結果的可重復性,并在細胞培養物受到污染或丟失時提供備用細胞來源。


  冷凍細胞是一個較為復雜過程,由于水是活細胞中最重要的成分,當水結冰時,細胞代謝就會停止。經過適當的解凍程序后,細胞會恢復正常的生物活動。


  冷凍保存細胞有許多優點,但由于細胞暴露在冷凍保護劑中并且冷凍所需的低溫下,該過程可能會給細胞帶來壓力。上海通蔚為大家介紹大多數細胞冷凍方案。


  選擇正確的冷凍介質


  選擇正確的冷凍培養基取決于細胞系和應用,并且需要進行優化以確保解凍后最高的活力。


  對于大多數應用,應該考慮使用生長培養基血清或市售的冷凍培養基,例如二甲基亞砜(DMSO)。在開始細胞冷凍方案之前,請確保您已經準備好適合懸浮細胞的溫度和體積的冷凍培養基。


  在進入冷凍程序之前,請記住在與細胞混合后多次上下吹打培養基以確保單細胞懸浮。此外,最好不要將懸浮液倒入低溫小瓶中,因為這將大大增加污染風險。


  低溫瓶和標簽


  用于冷凍細胞的任何小瓶都應適合低溫應用。這些小瓶應由聚丙烯制成,可承受低至-196°C的溫度。使用聚酯低溫小瓶和可耐受超低溫的粘合劑為您的小瓶貼上標簽。在粘貼到小瓶之前,請在標簽上打印所有重要信息,例如日期、細胞類型、識別號和濃度。


  細胞冷凍率和長期儲存


  將細胞分裝到貼有適當標簽的低溫小瓶中后,即可開始冷凍程序。與解凍細胞不同,冷凍過程是一個緩慢、可控的過程。讓冷凍保護劑有時間從細胞中去除水分至關重要,這可以降低因冰晶形成而造成損害的風險。


  當細胞被快速冷凍時,水和離子往往會留在細胞中。這最大限度地減少了溶質濃度效應和脫水。然而,細胞內的冰形成會通過撕裂和刺穿細胞膜造成嚴重損害。相反,如果細胞緩慢冷凍,細胞外的水會在細胞內冰形成之前結冰。這允許水通過滲透逸出,但會增加細胞內溶質的濃度,而這可能是有毒的。


  實際上,非常快和非常慢的冷凍速度都會導致過量冰形成或溶質毒性增加。DMSO等冷凍保護劑可促進脫水、減少冰結晶并降低溶質效應。對于大多數細胞來說,最佳冷凍速度是每分鐘1°C。正如您在圖表中看到的,在這個溫度范圍內,細胞內冰形成的負面影響與溶質濃度的增加達到平衡。



  這將使細胞活力達到最大。


  冷凍細胞通常是一個兩步過程,其中細胞以緩慢、可控的速率冷卻至-80°C,然后在-135°C或更低的溫度下長期儲存。


 步驟1:以控制的速率將細胞冷凍至-80°C


  如前所述,必須使用控速冷凍機或控速容器將細胞以每分鐘約-1°C的速率冷卻至-80°C。


  將凍存瓶放入容器后,可將其放入-80°C冰箱中過夜。12小時后,凍存瓶即可轉移至液氮冰箱中進行長期保存。


  值得注意的是,應避免將細胞在-80°C冰箱中儲存超過兩周。在此溫度下儲存時間過長會導致細胞死亡和樣品活力降低。


  步驟2:在液氮中長期儲存


  液氮儲存方法有兩種基本類型。一種是將小瓶直接浸入液體中。另一種是將小瓶置于液體上方的氣相中。


  氣相系統在容器內形成垂直溫度梯度。在底部,液氮將保持約-196°C的溫度。


  氣相溫度在到達容器頂部時會升高。應使用足夠的液氮,以確保罐頂部最熱部分的溫度始終低于-135°C


  我們建議將小瓶儲存在氣相中,而不是液相中。代謝活動在-135°C時停止,而液相的額外低溫并沒有帶來真正的好處。


  事實上,將小瓶浸入液相中存在部分液氮可能滲透并損壞小瓶的風險。


  對于從事免疫學、毒理學和其他科學領域的研究人員和實驗室工作人員來說,學習如何冷凍細胞并使其在解凍后保持最大活力是一項重要技能。


  總而言之,制定細胞冷凍方案時主要考慮三個因素:冷凍介質的類型和濃度、低溫小瓶的類型、最佳冷凍速度和長期儲存溫度。


  最好使用含有冷凍保護劑(如DMSO)的冷凍介質來冷凍健康且可存活的細胞。


  冷凍培養基細胞濃度取決于細胞和應用,因此需要進行優化以實現長期儲存。


  低溫瓶應帶有外螺紋,額定溫度為-196°C


  冷凍細胞時,確??刂评鋮s速度為-1°C/min,直至達到-80°C,然后轉移到液氮罐的氣相中進行長期儲存。



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