在進行酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測蛋白質往往離不開純化，蛋白質純化是從復雜的生物材料混合物（例如細胞提取物或培養(yǎng)上清液）中分離出特定的目標蛋白質。目標是獲得高純度的所需蛋白質，同時有效去除污染物等，使得使得ELISA檢測結果更具特異性和靈敏性。接下來上海通蔚帶大家了解下蛋白質純化。

  蛋白質純化目的

  了解蛋白質純化的目的對于有效的資源分配、質量控制和實驗設計至關重要。它確保純化過程能夠滿足特定目標，無論是獲取高純度蛋白質、最大化產量、保持蛋白質活性，還是滿足下游實驗和應用的標準。

  這種清晰度提高了蛋白質純化的整體效率和成功率，有助于更有效的研究和生物技術進步。蛋白質純化的主要目標如下：

  1.獲得樣品的高純度：主要目標是分離高純度的目標蛋白質，去除其他分子和污染物。

  2.與污染物分離：蛋白質通常與其他生物分子（如核酸、脂質和其他蛋白質）一起存在于復雜的混合物中。純化的目的是將目標蛋白質與這些污染物分離。

  3.保持蛋白質的完整性：純化過程不應改變蛋白質的結構、活性或生物功能。蛋白質應盡可能保持其天然狀態(tài)。

  4.定量和濃縮：確定純化蛋白的濃度對于后續(xù)實驗至關重要?？赡苄枰獙⒌鞍诐饪s到更高濃度。

  5.可靠且可重復的結果：凈化過程應可靠且可重復，以便在研究或生產中獲得一致的結果。

  蛋白質純化工作流程的主要步驟是什么

  典型的蛋白質純化工作流程始于識別蛋白質來源。這通常是蛋白質天然存在的細胞或組織類型?；蛘?，感興趣的靶標可以在宿主細胞系中重組產生。在這種情況下，蛋白質通常被設計為在N端或C端表達融合標簽，以方便分離和檢測。

  接下來，必須破碎細胞以釋放蛋白質含量。機械方法包括均質化和超聲處理，而非機械方法則包括使用洗滌劑和有機溶劑。方法的選擇取決于樣品類型和目標，但應始終使用適當的緩沖液、蛋白酶抑制劑和其他藥劑來防止蛋白質降解并保持溶解度。

  一旦蛋白質溶解，就可以進行純化，如下所述。之后，使用包括SDS-PAGE、質譜、X射線晶體學和各種功能測定在內的方法進行蛋白質表征和分析。

  1.蛋白質純化方法

  蛋白質純化方法利用溶解度、大小、電荷和分子識別等特性來分離目標靶標。以下是一些主要方法：

  2.沉淀

  沉淀法使用鹽、有機溶劑或pH值變化來改變蛋白質溶解度并引起聚集。雖然這些技術可能會導致不需要的蛋白質共沉淀，但它們可作為初始純化步驟，尤其是在處理大量蛋白質時。

  3.離心

  離心法根據密度分離蛋白質。雖然基本離心法廣泛用于從粗樣品中去除細胞碎片，但差速離心和密度梯度離心等技術可進行粗分離，通常作為多步純化方案的一部分。

  4.透析和超濾

  透析和超濾根據蛋白質通過選擇性滲透膜的能力，按分子量分離蛋白質。透析涉及被動擴散，而超濾利用壓力（通常是離心力）來驅動蛋白質運動。這些方法常用于脫鹽、緩沖液交換和濃縮蛋白質溶液。

  5.色譜法

  色譜法通過蛋白質與固體支持物（固定相）的相互作用來分離溶液中的蛋白質混合物（流動相）。色譜法包括以下幾種，其中許多已適用于快速蛋白質液相色譜法(FPLC)，這是一種使用泵控制流速的方法：

  1)尺寸排阻色譜法(SEC)可按蛋白質大小分離通過充滿多孔珠的色譜柱的蛋白質。較大的蛋白質會先繞過孔隙，從而先洗脫，而較小的蛋白質則需要更長的時間才能穿過色譜柱。

  2)離子交換色譜法(IEX)使用帶電樹脂，根據蛋白質在特定pH下的凈電荷來分離蛋白質。通過增加鹽濃度或改變緩沖液的pH值來進行洗脫。

  3)疏水相互作用色譜法(HIC)使用高鹽結合緩沖液和疏水性樹脂，根據疏水性分離蛋白質。降低鹽濃度會導致疏水性最差的蛋白質首先離開色譜柱，然后是疏水性較強的蛋白質。

  4)親和層析利用蛋白質與其配體之間的特定相互作用，例如抗體與抗原（例如蛋白質標簽）結合。與通常構成多步純化方案一部分的SEC、IEX和HIC不同，親和純化通?？梢韵龑ζ渌兓呗缘男枨?。

  上述是上海通蔚為大家介紹蛋白質純化及常見的方法，蛋白質純化為ELISA實驗提供了更純凈、活性更高的樣品，這不僅提高了檢測的準確性和靈敏度，也能降低實驗中的誤差和試劑消耗，使實驗結果更加可靠。